Analisis DNA

Practice report                                                                                                                                                                    29th May 2009

Fundamentals of  Fish Genetics

 

ANALISIS DNA

Gia Marta Novia, C14070034, Group 5, Shift 2.

 

 

Abstrak

Analisis DNA banyak digunakan untuk karakterisasi sifat genetik pada level molekuler yang secara langsung mencerminkan sifat genotip yang dimiliki oleh organisme tertentu. Analisa pada level ini jauh lebih akurat jika dibandingkan dengan analisa fenotip atau morfometrik. Tujuan praktikum kali ini yaitu untuk menganalisis DNA suatu spesies ikan nila, ikan gurame, ikan barbir, dan ikan zebra. Dalam kegiatan analisa DNA melalui tahap-tahap yaitu ekstraksi DNA, Polymerase Chain Reaction atau PCR dan elektroforesis. Jenis ikan yang digunakan dalam pratikum analisis DNA adalah ikan gurame (Osphronemus gouramy), ikan nila (Oreochromis niloticus), ikan barbir (Puntius conchonius), ikan zebra (Brachyodanio reiro). Primer yang digunakan tidak spesifik pada sekuen DNA ikan barbir, dan konsentrasi DNA yang digunakan sedikit atau rendah sehingga hasil elektroforesis tidak terlalu jelas.

 

Kata kunci: Analisis DNA,  Ekstraksi DNA, PCR (Polimerase Chain Reaction), Elektroforesis.

 

 

Pendahuluan

DNA merupakan suatu unit terkecil dari makhluk hidup yang merupakan pembawa sifat keturunan. Analisa DNA banyak digunakan untuk karakterisasi sifat genetik pada level molekuler yang secara langsung mencerminkan sifat genotip (materi genetik) yang dimiliki oleh organisme tertentu. Analisis DNA ini terdiri dari tiga tahap yaitu ekstraksi DNA, PCR, dan    elektroforesis.

Analisa pada level ini jauh lebih akurat jika dibandingkan dengan analisa fenotip atau morfometrik karena ciri fenotip merupakan hasil interaksi antara genotip dan lingkungannya. Tujuan praktikum kali ini yaitu untuk menganalisis DNA suatu spesies ikan nila, ikan gurame, ikan barbir, dan ikan zebra.

 

Metodologi

Pelaksanaan praktikum mengenai analisa DNA dilaksanakan pada hari Jum’at tanggal 8, 15, dan 22 Mei 2009 pada pukul 07.00-11.00 WIB  bertempat di Laboratorium Genetik, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.

Alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah adalah sentrifuse, mikropipet, tube, PCR, lemari es, inkubator, elektroforesis, vortex, dan sinar UV. Sedangkan bahan yang dipakai adalah sampel DNA, Cell Lysis Solution, Porteinase K, RNase, Protein Precipitation Solution, etanol 70%, DNA Rehydration Solution, SDW, isopropanol, ExTaq Polymerase, gel agarosa, bromophenol Blue, daging ikan zebra, gurame, barbir, dan nila.

Prosedur praktikum ini dilakukan dengan tiga tahapan, yaitu ekstraksi dna, PCR (polymerase chain reaction), dan elektroforesis. Pada ekstraksi DNA, pertama-tama sampel ditimbang seberat 5-10 mg, lalu ditambahkan 300µl cell lysis solution kemudian dicacah. Lalu ditambahkan 1,5 µl proteinase k (20 mg/ml) dan diinkubasi pada suhu 55oC selama 24 jam, biarkan sampai mencapai suhu ruang lalu ditambahkan 1,5µl RNase (4 mg/ml), aduk 25 kali dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit. Setelah itu dicampurkan 100 µl protein precipitation solutio yang kemudian divortex selama 20 detik pada kecepatan tinggi dan disimpan di kulkas selama lima menit. Sentrifuse dilakukan pada 14.000 rpm selama tiga menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tube baru yang telah diisi 300 µl isopropanol, diaduk sebanyak 50 kali. Lalu disentrifuse pada 14.000 rpm selama 1 menit, supernatan dibuang dan ditambahkan 300 µl etanol 70 %. Setelah itu etanol dibuang dan pellet DNA dikeringkan selama 15 menit. Setelah itu 50 µl DNA rehydradtion solution ditambahkan dan diinkubasi pada 65oC selama 1 jam. Langkah kedua dalam analisa DNA yaitu pertama adalah larutan premix dibuat yang terdiri dari 10xBuffer ExTaq sebanyak 8µl, DNTP 8 µl, primer forward dan reverse masing-masing 8 µl, ExTaq DNA Polymerase sebanyak 0,5 µl, SDW 39,60 µldan sampel 8 µl. Larutan dibagi kedalam masing-masing microtube. Setelah itu dimasukkan ke dalam PCR yang telah diset ; pengkondisian awal 94oC selama 4 menit, kemudian siklus PCR yang meliputi denaturasi 94oC selama 45 detik, annealing 50oC selama 45 detik dan ekstension 72oC selama 3-7 menit. Kemudian penstabilan 72oC selama 3-7 menit. Langkah terakhir dalam analisa DNA yaitu elektroforesis pertama-tama pembuatan gel agarosadengan menimbang sebanyak 0,3 gram lalu dimasukkan kedalam larutan Tris Borate EDTA yang mengandung Ethidium Bromida sebanyak 30 ml. Lalu dipanaskan dalam microwave selama 5 menit (100 volt). Setelah itu campuran tersebut dimasukkan kedalam cetakan agarosa. Gel dibiarkan membeku kemudian dimasukkan ke dalam bak elektroforesis yang telah berisi larutan buffer elektroforesis. Pemakaian elektroforesis sekitar 3 µl volume sampel yang akan dicek dicampur dengan 0,5 µl loading buffer yang mengandung bahan pemberat DNA dan pewarna. Campuran  dimasukkan kedalam sumur – sumur yang terdapat dalam bak elektroforesis. Kemudian diamati dengan berjalan pada tegangan 150 volt, dan kuat Arus 60 mA.

 

Hasil dan Pembahasan

Berikut ini dilampirkan gambar hasil elektroforesis dan hasil PCR.

Gambar 1. Hasil elektroforesis (hasil ekstraksi DNA+ hasil PCR).

 Diketahui bahwa jenis ikan yang dipraktikum dalam analisa DNA adalah ikan gurame (Osphronemus gouramy), ikan nila (Oreochromis niloticus), ikan barbir (Puntius conchonius), ikan zebra (Brachyodanio reiro), gabungan ikan gurame dan ikan nila, gabungan ikan nila dan ikan barbir, lalu gabungan ikan barbir dan ikan zebra. Dari gambar diketahui sebelah kiri adalah hasil elektroforesis PCR, dan kanan  adalah hasil elektroforesis ekstraksi DNA. Gambar memberikan informasi bahwa pada gabungan ikan barbir dengan ikan zebra, primer tidak dapat membedakan DNA.

DNA adalah suatu molekul primer yang keberadaannya selalu terkait dengan RNA dan protein. Sedangkan dalam menganalisis DNA yang diperlukan adalah DNA dalam bentuk murni (Stine, 1973). Karp (1984) menyatakan bahwa langkah pertama dalam  mengekstraksi DNA adalah menghancurkan sel dan mengisolasi asam nukleat. Dalam ekstraksi DNA jenis sumber sel yang digunakan ada beberapa macam seperti hati, otot, sirip, darah, dan sel hasil kultur. Sedangkan kondisi sumber sel meliputi sumber sel segar, sumber sel terfikasasi dan sumber sel beku (Sambrook, 1989). Pada saat diisolasi, inti sel biasanya tersuspensi dalam larutan garam buffer, yang kemudian ditambahkan dengan sedikit larutan deterjen pekat seperti SDS (Sodium Doecyl Sulfat). Deterjen juga bertindak sebagai penghambat semua aktivitas enzim nuklease yang ada selama proses ekatraksi. Langkah yang kedua dalam ekstraksi adalah pemisahan DNA dari bahan-bahan kontaminan seperti RNA dan protein, dimana untuk menghilangkan protein digunakan proteolitik (Proteinase K) pada larutan DNA dan untuk menghilangkan kontaminan RNA digunakan enzm RNase (ribonuklease) (Saunders & Parkes, 1999 dalam Octavera,2008), serta pengendapan DNA dengan proses sentrifuse, dimana dalam proses sentrifuse asam nuleat diendapkan dengan penambahan etanol dingn, dan pellet yang terbentuk dilarutkan kemabila dengan buffer yang m engandung SDW (Steril Destillation Water) dan pemanenan. Hasil ekstraksi DNA tersebut merupakan tahapan yang penting untuk prosedur berikutnya, sehingga ekstraksi DNA harus dilaksanakan dengan baik dan bebas kontaminansi (Sulandari dan Zein, 2003).

Dalam analisa DNA selanjutnya dilakukan PCR, Menurut Lisdiyanti (1997) prinsip analisa PCR adalah reaksi memperbanyak DNA dengan memnafaatkan cara replikasi DNA dengan bantuan enzim DNA polimerase dan perubahan sifat fisik DNA terhadap suhu. Replikasi DNA terjadi jika DNA utas tunggal yang bertindak sebagai cetakan, dan ada energi pembangun basa yaitu dNTP, maka enzim DNA polimerase akan mengatalisis pembuatan DNA utas lain yang merupakan komplemen utas dari cetakan. Reaksi ini harus dimulai dengan adanya primer atau pemula.

Dalam proses PCR dilakukan sejumlah siklus yang digunakan untuk mengamplifikasi suatu sekuen DNA spesifik. Satu siklus terdiri dari tiga tahapan yaitu denaturasi, annealing (hibridisasi), dan ekstensi (polimerasi). Denaturasi dilakukan pada suhu 90-95˚C, pada tahap ini terjadi pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang menjadi cetrakan sebagai tempat penempelan primer dan tempat kerja DNA polymerase (Sulandari dan Zein, 2003). Kemudian dilanjutkan dengan tahap annealing yaitu tahap pelekatan primer pada masing-masing untaian pita DNA, dengan menggunakan suhu sedang. Setelah itu pada tahap extention, enzim DNA polimerase akan bekerja memperpanjang primer hingga terbentuk untaian pasangan basa pada sepanjang target sekuens DNA. Ketiga tahap ini akan diulang kembali sampai 25-30 ulangan (Arnheim, 1990).

Selanjutnya tahap elektroforesis merupakan suatu proses migrasi dari fragmen DNA di dalam gel yang direndam dalam larutan penyangga. Pada pratikum ini primer yang digunakan adalah primer FBPA ( 5΄GAC AAC GGM TCY GGY 3΄), dan primer RBP 1 (5΄ TAG AAG GTG TGR TGC 3΄).

Metode elektroforesis ini dapat dikelompokkan menjadi tiga langkah pertama, persiapan gel agarosa dengan konsentrasi agarose yang disesuaikan dengan ukuran DNA fragmen yang akan dipisahkan. Kedua, DNA sampel dimasukkan ke dalam lubang gel dan gel ditaruh di bak elektroforesis yang dialiri listrik dengan tegangan dan waktu tertentu sehingga menghasilkan pemisahan yang baik. Pada tahap ketiga, gel direndam dalam etidium bromida atau etidium bromida telah digunakan pada gel dan penyngga elektroforesis. Hasil elektroforesis ini dapat dilihat langsung pada penyinaran dengan sinar UV (Lewin, 1994). Perjalanan DNA ini dipengaruhi oleh arus listrik, The electric current gived between two electrode causes DNA move from negative pole to positive pole (Permana, 2008).

 

Conclusion

 Pada pratikum ini dapat disimpulkan bahwa praktikan sudah dapat menganalisa DNA yang melalui tiga tahapan yaitu ekstraksi DNA, PCR, dan Elektroforesis dari empat jenis ikan yang digunakan yaitu ikan gurame (Osphronemus gouramy), ikan nila (Oreochromis niloticus), ikan barbir (Puntius conchonius), ikan zebra (Brachyodanio reiro). Primer yang digunakan tidak spesifik pada sekuen DNA ikan barbir, dan konsentrasi DNA yang digunakan sedikit sehingga hasil elektroforesis tidak terlalu jelas.

References

Sulandari S & Zein M.S.A. 2003. Panduan Praktis Laboratorium DNA.. Jakatra. Lembaga Ilmu Pengetahan Indonesia.

Gusrina,  2002.  Pengaruh     Inbreeding      Terhadap

Karakter Fenotip Ikan Nila Gift (Oreochromis niloticus). (Tesis). Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut PertanianBogor.

 

Handoyo Boyun. 2002. Fluktuasi Asimetri Pada Ikan Kerapu Tikus (Cromileptes altivelis) di Balai Budidaya Air Payau (BBAP) Situbondo, Jawa Timur. [Skripsi]. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.

Karp, G. 1984. Cell Biology 2nd. Mc Graw Hill Inc. USA.

Lisdiyanti, P. 1997). Polimerase Chain Reaction : Cara Mudah Memperbanyak DNA. Warta Biotek.

Octavera Anna. 2008. Isolasi Promoter β-Actin Ikan Nila (Oreochromis niloticus). [Skripsi]. Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.

Sambrook, J. Dkk. 1997. Molecular Clonning ; A Laboratory Manual 2nd. Cold Spring Harbor Laboratory Press Book 1 dan 2.

 

 

About Gya's Blog

"Gya" Mahasiswi IPB (2007)...Mayor Teknologi dan Management Perikanan Budidaya...

Posted on 09/01/2012, in Sains and tagged . Bookmark the permalink. Tinggalkan komentar.

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s

%d blogger menyukai ini: